# 핵심 요약 이 연구는 고탄수화물 식이가 nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD(비알코올성 지방간질환)의 진행과 연결되는 과정에서 장내 미생물 변화, 인슐린 저항성, 간 de novo lipogenesis, DNL(신생지방합성)이 어떻게 상호작용하는지를 조사했다. 간 생검으로 질환 상태가 확인된 한국인 204명의 식이, 임상 지표 및 16S rRNA 장내 미생물 자료를 분석하고, 이 중 90명의 간 전사체를 조사했으며, NAFLD가 없는 한국인 건강 쌍둥이 코호트 682명으로 미생물 결과를 비교했다. 탄수화물 에너지 비율이 70% 이상인 high carbohydrate, HC(고탄수화물)군에서는 NAFLD activity score, NAS가 높아질수록 장내 미생물 조성이 유의하게 달라지고 Enterobacteriaceae가 증가하며 Ruminococcaceae가 감소했지만, low carbohydrate, LC(저탄수화물)군에서는 같은 양상이 나타나지 않았다. HC군에서는 간 DNL 조절자인 SREBF2 증가와 SIRT1 감소가 질환 활성도와 연관되었고, kernel causality 분석은 Enterobacteriaceae 증가가 SREBF2 상향 조절에 영향을 주며 인슐린 저항성 지표가 간 손상 지표와 연결되는 경로를 제시했다. 저자들은 습관적인 고탄수화물 섭취가 장내 미생물 재편, 포도당 항상성 손상 및 간 DNL 유전자 활성화를 함께 유도하여 NAFLD 병인에 기여한다고 결론지었다. # 연구 배경과 질문 NAFLD는 대사증후군, 비만, 당뇨병뿐 아니라 유전적·식이 위험요인과 연관된다. 특히 nonalcoholic steatohepatitis, NASH(비알코올성 지방간염)와 진행된 섬유화는 불량한 임상 결과와 연결되어 약물치료 대상이 될 수 있지만, NAFLD에서는 대사기능 이상을 조절하기 위한 비용효과적인 일차 개입으로 생활습관 교정이 우선된다. 이에 따라 식이 패턴이 NAFLD 진행에 영향을 주는 기전을 규명할 필요가 있다. NAFLD에서 간으로 유입되는 지방은 주로 탄수화물로부터 합성되는 DNL, 지방조직 지방분해에서 유래한 free fatty acid, FFA(유리지방산), 장에서 흡수되는 chylomicron 형태의 식이 지방에서 온다. 고인슐린혈증을 동반한 NAFLD 환자에서는 총 간 triglyceride, TG(중성지방)의 최대 26%가 DNL에서 유래하고, 혈청 non-esterified fatty acid가 약 59%, 식이가 약 15%를 차지한다. NAFLD 환자의 DNL 속도는 BMI가 일치하는 건강 대조군보다 3배 높으며, 순환 포도당과 인슐린도 간 DNL을 유도할 수 있다. 선행 연구에서는 비비만 NAFLD 환자에서 장내 미생물 다양성과 조성이 달라지고 Ruminococcaceae가 감소하며 Veillonellaceae가 증가하는 것으로 보고되었다. 총 에너지의 4%만 탄수화물로 공급한 2주간의 극단적 탄수화물 제한 식이는 엽산 생성 장내 미생물을 조절하여 간 지방대사를 개선했고, 4주간 섬유소 섭취를 늘린 개입은 과체중 인구에서 장내 미생물 매개 포도당 항상성을 변화시켰다. 그러나 인간에서 다량영양소, 장내 미생물 및 NAFLD 진행의 기계적 연결은 충분히 규명되지 않았다. 본 연구는 간 생검으로 잘 특성화된 NAFLD 코호트에 multi-omics(다중오믹스) 분석을 적용하여 탄수화물 섭취 패턴, 장내 미생물 변화, 인슐린 반응 손상 및 간 DNL 사이의 관계를 밝히는 것을 목표로 했다. # 연구 대상과 실험·분석 방법 ## 임상 코호트와 간 조직학 연구는 진행 중인 Boramae NAFLD cohort, NCT02206841를 이용한 단면 연구로 수행되었으며, Boramae Medical Center 기관생명윤리위원회 승인(IRB No. 26–2017-48)과 서면 동의를 받았다. 총 204명의 한국인이 포함되었고, 간 생검으로 확인된 NAFLD 환자는 129명으로 nonalcoholic fatty liver, NAFL 70명과 NASH 59명이었으며, NAFLD가 없는 대조군은 75명이었다. 대상자는 총 에너지 중 탄수화물 비율을 기준으로 HC군과 LC군으로 나뉘었다. HC군은 탄수화물 에너지 비율 ≥70%인 107명, LC군은 <70%인 97명이었다. NAS는 지방증, 소엽 염증 및 ballooning(풍선변성) 점수를 합산하여 산정했다. NAS 0–2는 non-NASH인 N0, NAS 3–4는 borderline NASH인 N1, NAS 5–8은 definite NASH인 N2로 분류했다. HC군은 N0 38명, N1 37명, N2 32명이었고, LC군은 각각 37명, 33명, 27명이었다. 제1형 당뇨병과 진행성 섬유화 ≥F3인 대상자는 제외했다. 간 조직은 16 G 일회용 바늘로 채취하고 4% formalin에 고정한 뒤 paraffin에 포매했다. 길이 20 mm, 두께 3 mm의 검체를 hematoxylin and eosin 및 Masson’s trichrome으로 염색했다. 간 생검은 높은 TG, 낮은 HDL-cholesterol, 복부비만, 고혈압, 당뇨병 또는 인슐린 저항성, 임상적으로 의심되는 NASH 또는 간 섬유화 중 적어도 두 가지 위험요인이 있는 경우 시행했다. ## 식이 및 대사 지표 최근 1년의 평소 식이를 103개 항목 food frequency questionnaire, FFQ(식품섭취빈도조사)로 평가했다. 섭취 빈도는 전혀 먹지 않음부터 하루 3회까지 9단계로, 1회 섭취량은 소·중·대로 구분했다. CAN-Pro 5.0으로 일일 영양소 섭취량을 계산했다. 탄수화물 g에 4 kcal을 곱해 탄수화물 유래 에너지를 산출하고 이를 총 에너지 섭취량으로 나누어 탄수화물 에너지 비율을 구했다. 인슐린 저항성은 homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR과 adipose tissue insulin resistance, adipo-IR로 평가했다. ## 장내 미생물 분석 분변 시료의 16S rRNA amplicon sequencing 자료를 QIIME v1.8.0으로 처리했다. gg_13_5 Greengenes 데이터베이스와 97% 유사도 기준으로 operational taxonomic unit, OTU를 배정했고, UCLUST와 PyNAST로 대표 서열을 선택·정렬했다. Ribosomal Database Project classifier로 분류군을 배정하고 ChimeraSlayer로 chimera를 제거했다. Family 및 genus 수준 상대풍부도 표는 풍부도 0.001%, persistence 50% 기준으로 필터링했다. Genus 수준 OTU 표에서 Simpson diversity, Shannon diversity, Pielou evenness 및 species richness의 네 가지 alpha diversity 지수를 계산했다. Bray–Curtis 거리 기반 nonmetric multidimensional scaling, NMDS와 analysis of similarities, ANOSIM으로 beta diversity를 평가했다. Random forest로 NASH 예측에 중요한 미생물 family를 선정하고, MaAsLin2로 BMI, 연령, 성별을 보정한 다변량 연관 분석을 수행했다. PICRUSt2와 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG를 이용해 기능을 추론했으며, linear discriminant analysis effect size, LEfSe에서 LDA score 2.0을 기준으로 N0와 N1+N2 사이의 기능 차이를 선별했다. ## 비NAFLD 건강 쌍둥이 코호트 검증 및 비교에는 Korean Genome Epidemiology Study의 Healthy Twin cohort 682명을 이용했다. 같은 70% 기준으로 HC군 382명과 LC군 300명으로 분류했다. Hepatic steatosis index, HSI 30을 기준으로 NAFLD 위험을 구분했으며, HC군에서는 HSI ≥30이 246명, HSI <30이 135명, LC군에서는 각각 211명과 88명이었다. 이 코호트의 V4 영역 16S rRNA sequencing 자료에서 family와 genus 수준의 처리된 OTU 표를 사용했다. ## 유전형과 간 전사체 주요 NAFLD 관련 변이인 PNPLA3_rs738409 C>G, TM6SF2_rs58542926 C>T, SREBF2_rs133291 C>T, MBOAT7_rs641738 C>T 및 HSD17B13_rs72613567 adenine insertion을 TaqMan 5′ nuclease assay 또는 Sanger sequencing으로 분석했다. 간 전사체 분석에는 간 생검 NAFLD 코호트 90명의 조직을 사용했다. TRIzol로 total RNA를 추출했으며 평균 RNA integrity number는 8.35, 범위는 4.5–9.5였다. TruSeq Stranded Total RNA Sample Prep Kit로 cDNA library를 제작하고 Illumina platform에서 sequencing했다. STAR와 HTSeq로 원시 자료를 처리하고 DESeq2로 정규화 및 차등발현 분석을 시행했다. 간 DNL에 관련된 37개 전사체를 사전 선정하여 NAS와의 상관성 및 HC·LC군 간 발현 차이를 분석했다. ## 예측과 인과 분석 Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae 및 Veillonellaceae를 BMI, 연령, 성별에 추가한 NASH 예측 모델의 area under the receiver-operating characteristic curve, AUROC를 계산하고 DeLong test로 모델을 비교했다. 두 변수 사이에서 양방향 kernel regression을 수행하여 더 큰 상관계수를 나타내는 변수를 kernel cause로 판단하는 kernel causality analysis를 이용해 미생물, 전사체 및 임상 지표 사이의 인과 방향을 추론했다. # 대상자 특성과 영양소 섭취 HC군은 하루 총 에너지의 평균 76.83%를 탄수화물, 11.28%를 지방, 11.89%를 단백질에서 섭취했다. LC군은 탄수화물 63.56%, 지방 20.16%, 단백질 16.28%를 섭취했다. 절대량 기준으로 LC군은 HC군보다 총지방, 동물성 지방, 식물성 지방, 총단백질, 동물성 단백질 및 식물성 단백질 섭취량이 더 많았다. 전체 HC군과 LC군 사이에서 BMI는 유의하게 다르지 않았다(P=0.138). 저자들은 두 식이군의 기초 특성이 전반적으로 유사하다고 기술했으나, 표에서 gamma-glutamyl transferase, GGT는 HC군과 LC군 사이에 유의한 차이를 보였다(P=0.003). Ferritin의 군 간 차이는 P=0.054였다. NAS가 높아질 때 유의하게 달라진 주요 임상 지표는 다음과 같았다. | 식이군 | 지표 | N0 → N1 → N2 | P값 | |---|---|---:|---:| | HC | BMI, kg/m² | 25.3±3.8 → 27.3±3.8 → 27.4±3.9 | 0.021 | | HC | AST, IU/L | 30.2±19.2 → 41.2±24.8 → 71.2±75.5 | <0.001 | | HC | ALT, IU/L | 33.6±29.0 → 53.4±36.5 → 92.3±80.7 | <0.001 | | HC | GGT, IU/L | 35.9±37.1 → 47.2±67.7 → 54.5±41.1 | <0.001 | | HC | 총 bilirubin, mg/dL | 2.27±9.45 → 0.87±0.40 → 0.64±0.19 | 0.010 | | HC | C-peptide, ng/mL | 2.61±1.49 → 3.83±2.59 → 4.14±4.68 | 0.002 | | HC | hs-CRP, ng/mL | 0.18±0.49 → 0.20±0.31 → 0.24±0.38 | 0.018 | | HC | HbA1c, % | 5.96±1.06 → 6.03±0.63 → 6.29±0.87 | 0.031 | | HC | Insulin, μIU/mL | 12.9±10.1 → 15.6±7.46 → 16.9±8.01 | 0.005 | | HC | Adipo-IR | 45.0±35.3 → 59.9±35.8 → 71.7±45.2 | 0.007 | | HC | HOMA-IR | 3.17±3.17 → 3.98±2.24 → 5.05±3.50 | 0.002 | | LC | 연령, 세 | 57.7±8.9 → 46.0±16.9 → 46.2±12.1 | <0.001 | | LC | BMI, kg/m² | 25.2±2.8 → 28.9±4.0 → 29.0±3.7 | <0.001 | | LC | AST, IU/L | 25.3±8.8 → 62.6±62.6 → 61.8±41.4 | <0.001 | | LC | ALT, IU/L | 28.1±15.1 → 76.6±49.8 → 100.9±72.9 | <0.001 | | LC | GGT, IU/L | 46.5±51.9 → 62.6±42.1 → 65.2±38.9 | 0.008 | | LC | LDL, mg/dL | 106.7±32.5 → 107.3±42.6 → 131.5±23.2 | 0.034 | | LC | TG, mg/dL | 128.0±65.3 → 139.7±50.8 → 158.5±50.9 | 0.009 | | LC | Albumin, g/dL | 4.09±0.26 → 4.27±0.27 → 4.31±0.29 | 0.002 | | LC | C-peptide, ng/mL | 2.52±0.97 → 4.49±3.57 → 4.24±2.14 | <0.001 | | LC | hs-CRP, ng/mL | 0.17±0.32 → 0.19±0.15 → 0.31±0.32 | <0.001 | | LC | Ferritin, ng/mL | 105.3±56.2 → 263.3±311.7 → 228.0±146.6 | <0.001 | | LC | Insulin, μIU/mL | 11.4±5.44 → 17.3±7.87 → 17.5±8.72 | <0.001 | | LC | Adipo-IR | 43.7±30.4 → 74.0±70.7 → 71.7±52.5 | 0.003 | | LC | HOMA-IR | 2.95±1.53 → 5.19±3.11 → 4.76±3.60 | 0.001 | 비만은 BMI ≥25 kg/m²로 정의했다. 비만 비율은 HC군에서 N0 55%, N1 72%, N2 71%였고, LC군에서는 각각 43%, 81%, 85%였다. LC군에서는 NAFLD 조직학적 중증도가 심해질수록 체지방량과 내장, 피하 및 전체 복부 지방조직 면적이 유의하게 증가했다. # 탄수화물 섭취와 임상 지표의 연관성 탄수화물 섭취량은 HC군에서만 간 손상 지표인 serum alanine transaminase, ALT와 양의 상관관계를 보였다. BMI, 연령 및 성별을 보정한 뒤에도 HC군의 탄수화물 섭취와 ALT 사이 양의 연관성은 경계 수준으로 유지되었다(P=0.053). HOMA-IR과 adipo-IR 등 인슐린 저항성 대리지표도 HC군에서만 탄수화물 섭취량과 유의한 양의 상관관계를 보였다. 반면 LC군에서는 탄수화물 섭취가 LDL-cholesterol 및 TG와 같은 비만·지질대사 관련 지표와 유의하게 연결되었다. BMI, 연령 및 성별을 보정한 선형회귀에서 HC군의 탄수화물 섭취량은 FFA 농도, HOMA-IR, adipo-IR 및 insulin 농도를 유의하게 예측했다. LC군에서는 탄수화물 섭취량이 LDL-cholesterol과 BMI를 유의하게 예측했다. # HC군에서만 나타난 NAFLD 활성도 의존적 장내 미생물 조성 변화 Bray–Curtis 거리 기반 분석에서 HC군의 장내 미생물 조성은 NAS에 따라 유의하게 달라졌다(P=0.009). LC군에서는 같은 변화가 나타나지 않았다(P=0.742). HC군의 NMDS 점수를 세부 비교했을 때 borderline NASH인 N1과 definite NASH인 N2 사이에 유의한 차이가 있었다(P=0.0195). 그러나 Simpson diversity, Shannon diversity, Pielou evenness 및 species richness로 평가한 alpha diversity는 HC군과 LC군 모두에서 NAS 하위군 사이에 유의한 차이가 없었다. 따라서 관찰된 차이는 각 시료 내부의 균등도나 풍부도보다 미생물 군집 구성 자체의 재편에 해당했다. # Ruminococcaceae 감소와 Enterobacteriaceae 증가 단변량 분석에서 HC군의 NAFLD 활성도가 높아질수록 Ruminococcaceae family의 상대풍부도는 유의하게 감소했다(N2 대 N0, P=0.006). 반대로 Enterobacteriaceae는 유의하게 증가했다(N2 대 N0, P=0.010). Veillonellaceae는 definite NASH N2에서 non-NASH N0보다 증가했지만 경계 수준이었다(P=0.06). LC군에서는 NAFLD 활성도에 따른 유의한 미생물 분류군 변화가 관찰되지 않았다. Genus 수준에서도 HC군의 같은 방향성이 유지되었다. NASH 대상자는 non-NASH 대상자보다 Faecalibacterium이 유의하게 감소했고(N2 대 N0), unclassified Enterobacteriaceae가 유의하게 증가했다(N2 대 N0). Dialister는 N1에서 N0보다 유의하게 증가했다. Random forest 분석에서 전체 연구집단의 NAFLD 활성도 예측에 가장 중요한 미생물 변수는 Veillonellaceae, Ruminococcaceae 및 Enterobacteriaceae였다. HC군에서도 Ruminococcaceae와 Enterobacteriaceae가 핵심 변수로 선정되었다. LC군의 모델에서 선택된 미생물 변수들은 실제 NAFLD 활성도에 따라 유의하게 변화하지 않았다. BMI, 연령 및 성별을 보정한 MaAsLin2 분석에서도 HC군에서는 NAS 증가에 따라 Ruminococcaceae가 유의하게 감소하고 Enterobacteriaceae가 유의하게 증가했다. Figure 3 caption에 제시된 세 family의 분석값은 전체 집단에서 각각 P=0.0001, q=0.034; P=0.001, q=0.140; P=0.011, q=0.419였고, HC군에서는 P=0.002, q=0.035; P=0.005, q=0.202; P=0.014, q=0.341이었다. LC군에서는 P=0.102, q=0.71; P=0.264, q=0.84; P=0.149, q=0.026으로 캡션에 기재되었으며, 본문은 HC군과 같은 유의한 연관성이 LC군에서는 발견되지 않았다고 기술했다. # 장내 미생물의 예측 기능 변화 PICRUSt2와 LEfSe를 이용한 기능 예측에서 HC군의 N0와 NASH 하위군 N1+N2 사이에는 총 287개 KEGG category와 16개 KEGG pathway가 유의하게 달랐다. LC군에서는 유의하게 다른 KEGG category가 없었고 6개 pathway만 차이를 보였다. HC군 NASH 하위군에서 증가한 경로의 대부분은 미생물 탄수화물 대사와 관련되었다. 대표적으로 phosphotransferase system, PTS, glycerolipid metabolism, fructose and mannose metabolism이 포함되었다. 저자들은 HC 환경에서 탄수화물 이용 기회가 증가하는 것이 Enterobacteriaceae 증가와 연결될 가능성을 제시했다. # 비NAFLD 건강 쌍둥이 코호트와의 비교 고탄수화물 식이 자체가 NAFLD가 없는 사람의 장내 미생물을 변화시키는지 조사하기 위해 건강 쌍둥이 코호트 682명을 분석했다. HSI 30을 기준으로 위험군을 나누었을 때 HC군과 LC군 모두에서 HSI에 따른 장내 미생물 조성 및 alpha diversity의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. Figure 4에는 군집 조성 비교값으로 P=0.326과 P=0.633이 제시되었다. 세 핵심 family 가운데 Veillonellaceae는 전체 대상자뿐 아니라 HC군과 LC군의 높은 HSI 대상자에서 증가했다. HC군의 단변량 분석에서도 높은 HSI와 Veillonellaceae 증가가 확인되었다. 반면 간 생검 NAFLD 코호트에서 관찰된 Ruminococcaceae 감소와 Enterobacteriaceae 증가의 조합은 비NAFLD 코호트에서 재현되지 않았다. 저자들은 이를 고탄수화물 식이 또는 NAFLD 위험 하나의 독립적 효과라기보다, HC 섭취와 NAFLD 중증도의 상호작용이 장내 미생물 조성 변화에 기여한다는 근거로 해석했다. 또한 Veillonellaceae 증가는 중증 NASH보다는 간 지방증과 관련될 가능성을 제시했다. # 유전적 배경의 비교 분석한 다섯 가지 NAFLD 관련 변이 중 PNPLA3_rs738409 C>G의 유병률만 HC군과 LC군 모두에서 NAS 하위군 사이에 유의한 차이를 보였다. 그러나 PNPLA3_rs738409 minor allele frequency는 HC군과 LC군 사이에 유의한 차이가 없었다(P=0.612). 저자들은 따라서 HC군과 LC군에서 나타난 미생물 및 전사체 차이가 이 주요 유전적 배경의 차이로 설명되지 않는다고 판단했다. # HC와 LC에서 서로 다르게 조절된 간 DNL 전사체 간 생검 조직 90명에서 DNL 관련 37개 전사체를 분석했다. HC군에서 NAS와 음의 상관관계를 보인 유전자는 G6PC(P=0.049)와 SIRT1(P=0.001)이었고, 양의 상관관계를 보인 유전자는 HCFC1(P=0.016)과 SREBF2(P=0.041)였다. LC군에서는 USF1(P=0.021), NR1H3(P=0.008), MLXIPL(P=0.037)이 NAS와 역상관을 보였으며, SCD(P=0.009)와 mTOR(P=0.017)는 양의 상관관계를 보였다. Z score로 변환한 발현량을 비교했을 때 HC군의 N2는 N0보다 HCFC1 발현이 높고(P=0.018) SIRT1 발현이 낮았다(P=0.001). SREBF2는 NAFLD 활성도가 높아질수록 증가하고 G6PC는 감소했지만, N2 대 N0 비교는 각각 P=0.057과 P=0.072로 통계적 유의성에 도달하지 않았다. HC군의 SREBF2, SIRT1 및 HCFC1은 definite NASH N2에서 HC군과 LC군 사이에도 유의하게 달랐다. LC군에서는 NAFLD 활성도가 높아질수록 USF1, NR1H3 및 MLXIPL 발현이 각각 P=0.022, P=0.009 및 P=0.045로 낮아졌다. SCD는 N2에서 N0보다 높았고(P=0.009), mTOR는 N1과 N2 모두 N0보다 높았다(N0 대 N1 P=0.035, N0 대 N2 P=0.022). N0와 N1+N2를 직접 비교한 차등발현 분석에서 HC군의 SIRT1, FASN, SREBF2 및 HCFC1이 각각 P=0.002, P=0.014, P=0.029 및 P=0.042로 차등 발현되었다. LC군에서는 mTOR, SCD, GSK3B 및 MLXIPL이 각각 P=0.005, P=0.012, P=0.017 및 P=0.026으로 차등 발현되었다. 저자들은 HC군에서 DNL 조절자인 SREBF2와 Enterobacteriaceae의 관계를 추가 분석했다. BMI, 연령 및 성별을 보정한 선형회귀에서 SREBF2 발현은 HC군의 Enterobacteriaceae 풍부도를 유의하게 예측했다(P=0.006). 이 결과는 HC 식이 조건에서 NAFLD 활성도, 간 DNL 및 장내 미생물 군집이 밀접하게 연결되어 있음을 나타냈다. # 장내 미생물 family를 이용한 NASH 예측 간 생검으로 평가된 대상자에서 N0와 N1+N2를 구분하기 위해 Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae 및 Veillonellaceae를 예측 모델에 추가했다. HC군에서 BMI, 연령 및 성별만 포함한 모델의 AUC는 0.743, 95% confidence interval, CI는 0.625–0.860이었다. 세 미생물 family를 추가하면 AUC가 0.861, 95% CI 0.774–0.940으로 증가했으며, DeLong test에서 개선이 유의했다(P=0.018). LC군에서는 BMI, 연령 및 성별 모델의 AUC가 0.872였고, 세 미생물 family를 추가한 모델의 AUC는 0.874였다. 제시된 95% CI는 0.735–0.937이었으며, 두 모델의 차이는 유의하지 않았다(P=0.883). 따라서 세 미생물 family가 제공하는 추가적인 NASH 진단 정보는 HC군에서만 뚜렷했다. # 임상 지표·미생물·전사체의 인과 방향 분석 Kernel causality analysis에는 Ruminococcaceae와 Enterobacteriaceae, SREBF2·SIRT1·mTOR, ALT·AST·GGT·adipo-IR·HOMA-IR·insulin·FFA·BMI가 포함되었다. HC군과 LC군은 서로 다른 인과 네트워크를 보였다. HC군에서는 HOMA-IR과 adipo-IR 같은 인슐린 저항성 지표가 ALT, AST 및 GGT 같은 간 손상 지표에 양의 인과 효과를 나타냈다. Enterobacteriaceae 풍부도는 DNL 조절자인 SREBF2 증가에 양의 인과 효과를 보였으며, Enterobacteriaceae와 SREBF2는 모두 지질 생합성 억제 유전자인 SIRT1 감소에 관여했다. 고찰에서 저자들은 GGT도 HC군에서 SIRT1 발현 감소의 원인 변수로 나타났다고 설명했다. 이러한 네트워크는 과도한 탄수화물 섭취와 관련된 인슐린 감수성 저하, 간 손상, 장내 미생물 변화 및 DNL 억제자의 비활성화가 연결될 가능성을 제시했다. # 저자의 기전적 해석 Enterobacteriaceae는 기존 연구에서 당뇨병 환자의 지방조직과 혈장, 그리고 NAFLD 환자의 분변에서 증가한 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 HC 섭취가 당뇨병 대리지표와 연결되고 Enterobacteriaceae가 NAFLD 활성도에 따라 증가했으므로, 저자들은 Enterobacteriaceae가 당뇨병, 고탄수화물 식이 및 NAFLD 사이의 다요인성 연관에서 중심적인 위치를 차지한다고 해석했다. HC군 NASH에서 미생물 PTS가 증가한 결과도 Enterobacteriaceae가 충분한 탄수화물을 경쟁적으로 이용할 수 있다는 설명과 일치했다. Ruminococcaceae 감소는 소아 및 성인 NASH 연구에서도 보고되어 왔다. 본 연구에서는 Ruminococcaceae family에 속하는 Faecalibacterium 감소가 HC군의 진행된 NAFLD에서 family 수준 감소에 크게 기여한 것으로 해석되었다. Faecalibacterium이 생성하는 short-chain fatty acid, SCFA(단쇄지방산)는 간 DNL을 낮출 수 있고, Faecalibacterium prausnitzii 풍부도는 magnetic resonance spectroscopy로 측정한 간 지방 축적과 연결된 바 있다. 저자들은 이를 Ruminococcaceae, DNL 및 NAFLD 중증도 사이의 상호작용으로 설명했다. SREBF2가 암호화하는 SREBP2는 cholesterol, 지방산 및 phospholipid 합성 유전자의 전사를 활성화한다. 선행 연구에서 SREBF2 mRNA는 건강 대조군보다 NASH 환자에서 3배 높았고 acyl-CoA cholesterol acyltransferase는 1.5배 증가했다. 본 연구의 HC군에서도 SREBF2는 NAFLD 활성도와 함께 증가하고 Enterobacteriaceae와 연결되었다. 저자들은 만성 탄수화물 섭취가 SREBP 발현과 간 DNL을 높여 과도한 지질 축적과 NAFLD 발생에 기여할 수 있으며, 장내 미생물이 이 경로를 매개할 가능성을 제시했다. SIRT1은 간 DNL의 잠재적 억제자로, 동물과 인간 모델 모두에서 간 지방 축적을 억제하는 것으로 알려져 있다. SIRT1 결손 생쥐는 간 인슐린 저항성과 lipogenesis 증가를 보이며, SIRT1이 결실된 인간 induced pluripotent stem cell 유래 hepatocyte는 지방증과 염증을 포함한 NASH 표현형을 나타낸다. 따라서 HC군에서 NAFLD가 진행될수록 나타난 SIRT1 감소는 간 지질 및 포도당 항상성 손상과 연결되는 변화로 해석되었다. LC군에서는 mTOR가 진행된 NAFLD에서 증가했다. LC군은 HC군보다 상대적으로 지방 섭취가 많고 N1 및 N2의 비만 비율도 높았다. mTOR는 insulin signaling과 adipogenesis의 핵심 조절자이며, 고지방 식이 유도 비만 동물의 간에서 활성화되고 인간과 동물의 대사증후군 및 NASH와 연관된다. 저자들은 LC군의 mTOR 증가가 이 군에서 높은 비만 유병률과 연결될 가능성을 제시했다. # 고찰에서 제시된 한계 첫째, 연구가 단면 설계이므로 영양과 NAFLD 사이의 다수 기계적 인과관계를 직접 확정하기 어렵다. 저자들은 이를 보완하기 위해 HC와 LC군의 16S rRNA 미생물 자료를 비교하고 간 전사체를 분석했으며 kernel causality analysis를 적용했다. 그러나 다량영양소 중심 gut–liver axis(장–간 축)에 관한 결과를 검증하려면 동물실험과 인간 임상시험을 포함한 중재 연구가 필요하다고 밝혔다. 둘째, LC군의 NAFLD 병인은 충분히 규명되지 않았다. 아시아 NAFLD 인구의 전형적인 식이 특성 때문에 본 연구의 LC군도 에너지의 약 63.7%를 탄수화물로 섭취했으며, 이는 서구 NAFLD 인구의 약 44–46%보다 높다. 따라서 HC와 LC 식이의 효과를 명확하게 분리하기 어려웠다. 그럼에도 저자들은 LC군에서 비만이 NAFLD 중증도의 주요 기여요인임을 확인했다고 기술했다. # 결론 저자들은 습관적인 고탄수화물 섭취가 불리한 간 대사 및 NAFLD 중증도와 연관되며, 이 관계가 장내 미생물 변화와 연결된다고 결론지었다. HC 섭취는 인슐린 저항성 지표와 유의하게 연관되고, NAFLD 활성도가 증가할 때 장내 미생물 군집과 특정 분류군을 뚜렷하게 변화시켰다. 특히 Enterobacteriaceae 증가와 Ruminococcaceae 감소, 그리고 SREBF2 증가와 SIRT1 감소가 HC군에서 함께 관찰되었다. 이러한 미생물 분류군을 임상 변수에 추가하면 HC군의 NASH 예측력이 유의하게 향상되었다. 저자들이 제시한 전체 모델은 HC 조건에서 NAFLD가 진행될수록 병원성 장내 미생물이 증가하고 보호성 미생물이 감소하며, 이 변화가 간 DNL의 전사 활성화를 통해 숙주의 간 대사에 연결된다는 것이다. # 자료 공개와 이해상충 본 연구의 V4 16S rDNA 자료는 European Nucleotide Archive의 ERP109777에, 건강 쌍둥이 코호트 자료는 ERP010289에 등록되었다. 기타 metadata는 합리적인 요청 시 교신저자로부터 제공된다. GwangPyo Ko는 만성질환에서 host–microbiome interaction을 연구하는 KoBioLabs, Inc.의 창립자이며, 다른 저자들은 경쟁 이해관계가 없다고 밝혔다.

Interaction effect between NAFLD severity and high carbohydrate diet on gut microbiome alteration and hepatic de novo lipogenesis